分离培养及鉴定骨髓间充质干细胞的方法探析论文(干细胞分离的实验)

分离培养及鉴定骨髓间充质干细胞的方法探析论文

骨髓间充质干细胞（BMSCs）也被称为间质祖细胞，由于其巨大的增殖和多向分化潜能，被认为是再生医学、基因治疗和细胞治疗的理想种子来源，已被广泛进行研究[1-3].目前，BMSCs在动物实验和临床应用上取得了巨大的成果，在骨、软骨、肌腱、神经胶质修复、心脏疾病、心肌梗塞、肝脏损伤等方面取得了重大突破[4-6],并且可避免胚胎干细胞和异基因干细胞治疗所涉及的伦理道德和免疫排斥问题，有利于细胞移植。但是骨髓中的BMSCs含量极少，约占骨髓全细胞的0.001%~0.010%[7];因此，需要在体外分离纯化、培养扩增来满足临床应用和实验研究。研究表明，不同分离方法和首次换液方式对BMSCs的增殖培养有很大的影响[8].本试验通过观察2种不同分离方法和不同首次换液时间对兔BMSCs生物活性的影响，旨在建立一种有效的分离培养及鉴定BMSCs的方法，以便获得大量、高纯度、高活性、培养周期短的BMSCs,为下一步研究和临床实验提供基础。

1 材料与方法

1.1实验动物1月龄雄性新西兰大耳白兔1只，由河南省实验动物中心提供。

1.2主要试剂和仪器胎牛血清（北京四季青）；DMEM-F12（Gibco）；胰蛋白酶（北京拜尔迪生物公司）；DMSO（Gibco）；红细胞裂解液（北京赛驰生物技术有限公司）；生物素标记山羊抗兔IgG、HRP标记链霉亲和素、DAB显色试剂盒、改良型苏木素（北京华肽先锋）；兔抗兔CD34、CD44、CD99抗体（北京博奥森）；封闭山羊血清（北京博奥森）。

HF151UV型CO2培养箱（Heal Force）；倒置显微镜（Leica）;800型离心机、85-2恒温磁力搅拌器：金坛市大地自动化仪器厂；数码相机：日本佳能IXUS 980IS;电子天平：METTLER TOLEDO AL104;超净工作台：AIR TECH;FX101-2型电热鼓风干燥箱：上海树立仪器仪表有限公司；pH计：上海雷磁仪器厂。

1.3 BMSCs的提取用陆眠宁（846）将1月龄新西兰大耳白兔麻醉，腿部去毛消毒，无菌条件下分离股骨、胫骨，剔除脂肪和肌肉，PBS液反复冲洗，剪断两侧干骺端，尽量多保留干骺端，DMEM-F12培养液反复冲洗骨髓腔于A、B两个10mL的离心管内，直至骨髓腔发白，1 000r/min离心5min,弃上清。

1.4全骨髓贴壁法A管用PBS重悬细胞，1 000r/min离心5min洗涤2次，弃上清。吸取3mL含10%FBS的DMEM-F12（1∶100双抗）培养液重悬细胞，接种至3个25cm2培养瓶，补足培养液至5mL,轻柔吹打均匀。置于37℃、5%CO2条件下培养。以后每3d换液1次，待细胞生长融合至80%时传 代 培 养。 先 弃 去 旧 培 养 液，PBS液 浸 洗。0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA,37℃条件下孵育3min,含血清的DMEM-F12终止消化。以1∶2的比例传代培养，每3d换液1次。每天在倒置显微镜下观察细胞形态。

1.5红细胞裂解法B管加入1mL红细胞裂解液重悬细胞，静置1~3min,待液体由红色变为白色后，加 入5 mL PBS液，1 000r/min离 心2次，5min/次，弃 上 清。 吸 取3 mL含10% FBS的DMEM-F12（1∶100双抗）培养液重悬细胞，接种至3个25cm2培养瓶，补足培养液至5mL,轻柔吹打均匀。置于37℃、5%CO2条件下培养。

2d后首次换液，以后每3d换液1次，待细胞生长融合至80%时传 代 培 养。 先 弃 去 旧 培 养 液，PBS液 浸 洗。0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA,37℃条件下孵育3min,含血清的DMEM-F12终止消化。以1∶2的比例传代培养，每3d换液1次。每天倒置显微镜下观察细胞形态。

1.6兔BMSCs细胞活性检测及生长曲线绘制培养48h时，各取一瓶细胞，弃去培养基，用PBS冲洗2遍，倒置显微镜下观察细胞。0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化后，0.4%台盼蓝染色，血球计数板计数活细胞（未着色）和死细胞（着色细胞）。分别计算出2种不同分离方法的细胞活性。上述试验重复3次。

选取生长良好的P1、P3和P8代细胞，以2.0×104个/孔，接种于24孔培养板中，每孔1mL,每3d换液1次，每隔1d取3孔，消化后计数，取其平均值为当天的细胞数，连测8d,以培养时间为横坐标，细胞数为纵坐标，绘制细胞生长曲线。

1.7首次换液时间对兔BMSCs的影响将用红细胞裂解法分离得到的兔BMSCs按首次换液时间随机分为4组：12h换液组、24h换液组、48h换液组、72h换液组，以后每3d换液1次，记录传代前各组0~3代各代培养时间，各代细胞均保留3瓶。

1.8细胞免疫组化鉴定兔BMSCs收集红细胞裂解法的P3代细胞，制备细胞爬片，常规SABC免疫组织 化 学 方 法 检 测 表 面 抗 原CD34、CD、CD45、CD90的表达。

1.9统计学处理所得数据以均数±标准误表示，应用SPSS16.0统计学软件进行处理，采用单因素方差分析（one-way ANOVA），用Microsoft Excel软件作图。

2 结果

2.1不同分离方法对兔BMSCs形态和生长的影响

刚接种时，2种不同分离方法所得的原代细胞在倒置显微镜下观察细胞呈圆形，大小一致，折光性强，不容易区分。培养48h后，A、B两组细胞均可看见有圆形、短梭形、多角形细胞贴壁。

B组贴壁细胞较A组细胞多（图1）。台盼蓝染色检测细胞活性全骨髓贴壁法（A组）为90%,红细胞裂解法（B组）为96%.随着培养的继续，大量细胞贴壁，并出现典型的BMSCs细胞集落，紧密排列。

A组细胞生长较缓慢，所得细胞纯度较低；B组细胞生长较快，纯度较高。原代细胞达到传代的时间A组为10.2d,B组为7.2d,差异显着（P<0.05）。B组细胞P3代细胞呈旋涡状或放射状生长，细胞形态大小均一（图2）.

2.2兔BMSCs生长曲线绘制

通过细胞计数法绘制细胞生长曲线，对兔BMSCs的生长特性进行鉴定。结果显示，P1、P3、P8代细胞培养过程中，细胞生长具有相似的特点：1~2d细胞处于潜伏期；3~6d细胞处于对数生长期；6~8d生长逐渐减慢，开始进入平台期（图3）。传代细胞生长相对稳定，随着传代次数的增加，细胞会出现衰老的特征，增殖速度减慢。

2.3兔BMSCs的鉴定

结果显示，CD44、CD90抗原表达阳性，CD34抗原表达阴性（图4），符合BM-SCs表面分子标记特征。

2.4首次换液时间对兔BMSCs培养周期的影响红细胞裂解法分离兔BMSCs,分别在12,24,48,72h首次换液，结果（表1）显示，24h换液组P0、P1、P2、P3代以及总时间的细胞培养时间与其他各组比较差异极显着（P<0.01），表明24h首次换液可缩短细胞培养周期。

3 讨论

骨髓中BMSCs的含量很低，一般为0.001%~0.010%,其数量和生长能力与年龄呈显着负相关，想要在临床实践中利用BMSCs,就必须实现其在体外的分离培养和扩增。目前，常用的BMSCs的分离和纯化方法有：全骨髓贴壁法、红细胞裂解法、密度梯度法、免疫磁珠分选法和流式细胞术分选法，后2种方法筛选BMSCs的分选效率和纯度均较高，但是对实验条件和设备要求较高，费 用 昂 贵，并 且BMSCs表面缺乏特异性标志，在具体操作过程中可造成细胞的损伤和死亡，所以较少使用[9].密度梯度法由于分离液往往对BMSCs有一定的损伤，且离心会丢失大量的细胞，对细胞活性有影响，因此应用受到很大限制[10].本试验通过比较全骨髓贴壁法和红细胞裂解法，发现2种分离方法均可得到较均一的长梭形细胞，聚集成旋涡状均匀生长。但是红细胞裂解法分离得到的BMSCs在48h时贴壁细胞显着多于全骨髓贴壁法，并且细胞活性较高，细胞密度达到80%融合，首次传代时间也较短。这可能是因为全骨髓贴壁分离法保留了造血干细胞和其他杂细胞，在体外培养过程中混杂的细胞会对BMSCs的生长及贴壁产生影响，所得BMSCs纯度和细胞活性均较低；而红细胞裂解液的有效成分是氯化铵，能够利用红细胞的渗透脆性特异性的破坏无核红细胞膜而去除红细胞和血小板，并且对有核细胞无影响，从而去除骨髓中含量最高的细胞成分，经红细胞裂解液处理后，减小了杂细胞对其贴壁的影响，为BMSCs贴壁保留了空间，有利于BMSCs的早期贴壁[11],所得细胞纯度高，且细胞活力不受影响。因此，利用红细胞裂解法，能够在较短的时间里获得大量的高纯度、高活性的目的细胞，是一种有效的分离纯化BMSCs的方法。

有研究表明，首次换液时间对BMSCs的生殖增长有一定的影响。原代首次换液时间过早，由于骨髓冲洗液中其他细胞分泌滋养BMSCs的生长因子等多种有益成分丢失，贴壁细胞数量减少，细胞生长缓慢，细胞培养周期延长；原代首次换液时间过晚，杂质贴壁紧密，细胞代谢产物等有害成分增多，造血干细胞分泌的生长因子使BMSCs出现分化等，从而导致细胞增殖周期延长。本试验分别在12,24,48,72h首次换液，24h换液组，首次传代时间及细胞培养总周期与其他各组比较，差异有显着性意义，能显着缩短细胞培养时间，因此，培养24h首次换液为最佳首次换液时间。

BMSC目前还没有发现特异性的表面标记物，其鉴定尚无统一标准。

BMSC的表面抗原具有非专一性，表达内皮细胞、间质细胞、表皮细胞和肌肉细胞的表面标志，它包括（1）粘附分子CD44、CD105、CD166、CD54、CD102等；（2）整 合 素 家 族 成 员CD29、CD104、CD49a等；（3）其他CD90等[12-14].不表达造血干细胞表面标志，如CD34、CD45、CD11b、CD11a等[15-16].BMSCs,结 果 显 示，BMSCs阳 性 表 达CD90和CD44,造 血 干 细 胞 标 志CD34呈 阴 性 表 达，符 合BMSCs的表面标志物特征，证实我们体外分离培养的细胞为纯化的BMSCs.

综上所述，通过红细胞裂解液法分离得到的兔BMSCs生长增殖旺盛，生物学性状稳定，于培养24h首次换液可显着缩短细胞的培养周期，便于后续的试验研究。